生物学的生成物中の残留宿主細胞DNAのアッセイ方法の紹介

宿主細胞は生物学的産物の基礎であり、哺乳類の細胞株は現在、生物学的産物の発現と調製に最も広く使用されている宿主になっています。 一般的な宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣 (CHO) 細胞、アフリカグリーンサルの腎臓からのベロ細胞、およびヒト胚性腎臓 (HEK 293) 細胞が含まれます。

残留宿主細胞DNAのリスク

発がん性

の第一次発がん性メカニズム残留宿主細胞DNAMYCやRASなどの優性癌遺伝子の導入です。 これらの優勢な癌遺伝子は、正常細胞を直接形質化し、一部の正常細胞を腫瘍細胞に分化させる可能性があります。 残留宿主細胞DNAの挿入変異も潜在的な発がん性因子です。

感染症

残留宿主細胞DNAには感染性ウイルスゲノムが含まれている可能性があり、複製と転写増幅によって感染性ウイルス粒子を生成できます。 したがって、残留宿主細胞DNAの感染リスクは、その発がん性リスクよりも高い可能性があります。

免疫原性

微生物源からのゲノムDNAはCpGとメチル化されていない配列が豊富であるため、インビボでの組換えタンパク質薬の免疫原性リスクを高めます。 例えば、細菌からのCpGリッチ配列は、TLR (Toll様受容体) によって媒介される免疫応答を引き起こし得る。

残留宿主細胞DNAの検出方法

DNAプローブハイブリダイゼーション

この方法では、試験サンプル中の外因性DNAが一本鎖に変性され、固相膜に吸着される。 特定の条件下では、マーカーで標識された相補的な一本鎖DNAプローブと再ハイブリダイズして二本鎖DNAを形成することができます。 しかし、ハイブリダイゼーション法の検出結果は、実際の残留宿主細胞DNA含量と有意な矛盾があり、この方法は比較的長い検出時間で不安定である。

蛍光染色

この方法では、二本鎖DNAに特異的に結合して複合体を形成する二本鎖DNA蛍光色素を使用し、480 nmの波長で励起すると強い蛍光シグナルを生成します。 蛍光計を用いて520 nmでの蛍光シグナルを検出する。 蛍光強度はDNA濃度に比例する。 ただし、この方法の蛍光シグナルは干渉されやすく、特異性が低く、環境DNA汚染を回避する必要があり、使用されるすべての材料と試薬はDNAを含まない必要があります。

定量PCR

現在、宿主細胞DNA (HCD) を検出するための最も従来の方法であるこの技術は、テンプレートを定量的に分析するために、蛍光シグナルを介したPCRプロセスのリアルタイムモニタリングを含む。 化学原理に基づいて、TaqManプローブ法とSYBR染料法の2つのタイプに分けることができます。

TaqManプローブ法は、PCR反応中に蛍光色素で標識された遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを使用して生成物を検出しますが、SYBR色素法は、PCR反応システムに過剰な蛍光色素を追加します。 色素は特にDNA二本鎖に取り込まれ、蛍光シグナルを発する。 TaqManプローブ法は、プローブ認識ステップを通じて特異性を高めますが、SYBR色素法はより単純で簡単です。